TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN E HIBRIDACIÓN EN EL COVID-19

Técnicas de secuenciación e hibridación del SARS-CoV-2

La secuenciación de SARS-CoV-2 se puede hacer mediante el uso de métodos como: metatranscriptómica “Shotgun”, para secuenciar el ARN total o por la secuenciación de diana de nanoporos en tiempo real (NTS) que utiliza un secuenciador de nanoporos Oxford (1, 2). En este método, 11 fragmentos de genes relacionados con la virulencia de ORF1ab de SARS-CoV-2 se amplifican con un panel de cebadores para que luego los fragmentos amplificados se secuencien en una plataforma de nanoporos (1). Además, se puede hacer uso de un biosensor plasmónico de doble función que utiliza el efecto fototérmico plasmónico (PPT) y la transducción de detección de resonancia de plasmón superficial localizado (LSPR) para la detección del gen RdRp, ORF1ab y E de SARS-CoV-2 (1). La energía térmica PPT convertida, en la proximidad de nanoislas de oro, proporciona una fuente de calor para mejorar la hibridación in situ de RdRp de SARS-CoV-2 y su ADN complementario (1).

Referencias Bibliográficas:

1. Sheikhzadeh E, Eissa S, Ismail A, Zourob M. Diagnostic techniques for COVID-19 and new developments. Talanta [Internet]. 2020 [citado el 30 de enero de 2021]; 220:121392. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7358765/

2. Lopez-Alvarez D, Parra B, Cuellar WJ. Genome Sequence of SARS-CoV-2 Isolate Cali-01, from Colombia, Obtained Using Oxford Nanopore MinION Sequencing. Microbiol Resour Announc [Internet]. 2020 [citado el 30 de enero de 2021]; 9:e00573-20. Disponible en: https://mra.asm.org/content/9/26/e00573-20

RT- PCR EN EL COVID-19

RT-PCR para la detección de SARS-CoV-2

La RT-PCR cuantitativa en tiempo real, detecta y cuantifica las secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes (1). Los paquetes diagnósticos que emplea RT-PCR para la detección del SARS-CoV-2 funcionan mediante la lectura de la ARN polimerasa dependiente del ARN (RdRp), los fragmentos ORF1ab, el gen E y el gen N (1). El proceso comienza al recoger el material genético del virus mediante un frotis de nariz o garganta (2). La muestra de ARN obtenida se mezcla con Transcriptasa Inversa para obtener ADN retrotranscrito del virus (2). En un tubo de ensayo que contiene la muestra se añaden sondas que se unen a secuencias específicas del ADN retrotranscrito y emiten fluorescencia, mientras la computadora del equipo mide y presenta en pantalla los resultados en tiempo real (2). También se realiza un seguimiento de la magnitud de fluorescencia después de cada ciclo; así, al superar un determinado nivel, se confirma la presencia del virus (2).

Referencias Bibliográficas:

1. Cancino Mesa JF, Vitón Castillo AA, Casí Torres J. Empleo de la reacción en cadena de la polimerasa en la detección del SARS-CoV-2. Univ Méd Pinareña [Internet]. 2021  [citado el 23 de enero de 2021]; 17 (1): e574. Disponible en: http://www.revgaleno.sld.cu/index.php/ump/article/view/574/pdf

2. Salazar Carranza LA, Maldonado Santacruz FE, Cruz Villegas JA. La PCR como prueba para confirmar casos vigentes de COVID-19. RECIMUNDO [Internet]. 2020 [citado el 23 de enero de 2021]; 4 (2): 60-70. Disponible en: https://www.recimundo.com/index.php/es/article/view/824/1460

ALTERACIONES DE LA EPIGENÓMICA EN EL COVID-19

Alteraciones de la Epigenómica del SARS-CoV-2

El SARS-CoV-2 desarrolla funciones que antagonizan la máquina reguladora del epigenoma del hospedador creando un entorno permisivo para su replicación (1). Se ha visto que el SARS-CoV-2 se une con afinidad a la Enzima Convertidora de Angiotensina 2 (ECA2), cuya expresión en el ser humano está regulada por la metilación del ADN misma que se ha visto disminuida a mayor edad, explicando de esta manera la vulnerabilidad de los ancianos al COVID-19 (1, 2). Dicha metilación del ADN dependiente de la edad se detectó cerca del sitio de inicio de la transcripción del gen para ECA2 significando que los cambios en el epigenoma del huésped relacionados con la edad pueden representar un factor de riesgo en la infección por COVID-19 (1, 2).  De la misma manera, se ha visto que el SARS-CoV-2, al interferir con la maquinaria epigenética del hospedador, podría alterar la expresión de citocinas proinflamatorias, como IL-1, IL-6, IL-18, IFN-γ y TNF-α (1).

Referencias Bibliográficas:

1. Atlante1 S, Mongellil A, Barbi1 V, Martelli F, Farsetti A, Gaetano C. The epigenetic implication in coronavirus infection and therapy. Atlante et al. Clin Epigenet [Internet]. 2020 [citado el 16 de enero de 2021]; 12: 156. Disponible en: https://clinicalepigeneticsjournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13148-020-00946-x

2. Chlamydas S, Papavassiliou AG, Piperi C. Epigenetic mechanisms regulating COVID-19 infection. Epigenetics [Internet]. 2020 [citado el 16 de enero de 2021]. Disponible en: https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/15592294.2020.1796896?journalCode=kepi20

ALTERACIÓN DE LA TRADUCCIÓN EN EL COVID-19

 Alteración de la traducción del SARS-CoV-2

Una vez que el SARS-CoV-2 se encuentra dentro del citoplasma de la célula huésped se inicia la traducción del RNA viral (1, 2). Se traducen los ORFs 1a y 1b, próximos al extremo 5’, con lo que la célula fabrica las poliproteínas pp1a y pp1ab (1). Dos de los componentes de las poliproteínas catalizan la escisión de las mismas en proteínas individuales, entre ellas la RNA-polimerasa dependiente de RNA (1, 2). Esta polimerasa utiliza el RNA viral como plantilla para generar mRNAs específicos del virus a partir de cadenas subgenómicas (2). La traducción de los mRNAs subgenómicos genera proteínas virales estructurales y no estructurales (2). Cuando se han producido suficientes proteínas estructurales y RNA viral, se produce su ensamblaje y gemación con la consiguiente formación y liberación de viriones (1, 2).

Referencias Bibliográficas:

1. Ruiz-Bravo A, Jiménez-Valera M. SARS-CoV-2 y pandemia de síndrome respiratorio agudo (COVID-19). Ars Pharm  [Internet]. 2020  [citado el 09 de enero de 2021];  61 (2): 63-79. Disponible en: http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2340-98942020000200001

2. Accinelli RA, Zhang-Xu CM, Ju-Wang JD, Yachachin-Chávez JM, Cáceres-Pizarro JA, Tafur-Bances KB, et al. COVID-19: la pandemia por el nuevo virus SARS-CoV-2. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2020 [citado el 09 de enero de 2021]; 37 (2): 302-11. Disponible en: https://scielosp.org/article/rpmesp/2020.v37n2/302-311/

ALTERACIONES DE LA TRANSCRIPCIÓN EN EL COVID-19

Alteraciones de la transcripción del SARS-CoV-2

El genoma del SARS-CoV-2 es un RNA monocatenario de polaridad positiva (1). El RNA genómico se utiliza como plantilla, para traducir las poliproteínas 1a/1b, que codifican proteínas no estructurales para formar un Complejo de Replicasa-Transcriptasa (CRT) (1). Posteriormente, un conjunto de RNA subgenómicos son sintetizados por el CRT en forma de transcripción discontinua (1). La terminación de la transcripción y la posterior adquisición de una RNA iniciador se produce en las secuencias reguladoras de la transcripción ubicadas entre los Marcos Abiertos de Lectura (1). Estos RNA subgenómicos de cadena negativa sirven como plantillas para la producción de RNAm subgenómicos que codifican para las proteínas estructurales principales (S), (M), (E), (N) y accesorias (2).

Referencias Bibliográficas:

1. Gutiérrez Choque BJ, Aruquipa Quispe CJ. COVID-19: ASPECTOS VIROLOGICOS Y PATOGENESIS. Rev Cient Cienc Méd  [Internet]. 2020 [citado el 02 de enero de 2021];  23 (1): 77-86. Disponible en: http://www.scielo.org.bo/scielo.php?pid=S1817-74332020000100011&script=sci_arttext

2. Pastrian-Soto G. Bases Genéticas y Moleculares del COVID-19 (SARS-CoV-2). Mecanismos de Patogénesis y de Respuesta Inmune. Int. J. Odontostomat [Internet]. 2020 [citado el 02 de enero de 2021]; 14 (3): 331-337. Disponible en: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718-381X2020000300331